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谷胱甘肽還原酶（Glutathione Reductase, GR）活性測定試劑盒

商品貨號：QS1111
英文名稱：Glutathion Reductases(GR) Assay Kit
別名：谷胱甘肽還原酶試劑盒 GR Kit 谷胱甘肽還原酶（GR）試劑盒 谷胱甘肽還原酶（GR）測試盒
檢測方法：常量法

• 產品詳細介紹

測定意義：

GR是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)的關鍵酶之一（通常昆蟲中GR被TrxR取代）。GR催化NADPH還原GSSG生成GSH，有助于維持體內GSH/GSSG比值。GR在氧化脅迫反應中對活性氧清除起關鍵作用，此外GR還參與抗壞血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。

測定原理：

GR能催化NADPH還原GSSG再生GSH，同時NADPH脫氫生成NADP+；NADPH在340 nm有特征吸收峰，相反NADP+在該波長無吸收峰；通過測定340 nm吸光度下降速率來測定NADPH脫氫速率，從而計算GR活性。

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• 產品說明書
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貨號：QS1111                           規(guī)格：50 管/48 樣

谷胱甘肽還原酶（glutathione reductase, GR）活性測定試劑盒說明書

                               紫外分光光度法

注意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。

測定意義：

GR 是廣泛存在于真核和原核生物中的一種黃素蛋白氧化還原酶，是谷胱甘肽氧化還原循 環(huán)的關鍵酶之一（通常昆蟲中 GR 被 TrxR 取代）。GR 催化 NADPH 還原 GSSG 生成 GSH，有助于維 持體內 GSH/GSSG 比值。GR 在氧化脅迫反應中對活性氧清除起關鍵作用，此外 GR 還參與抗壞 血酸－谷胱甘肽循環(huán)途徑。

測定原理：

GR 能催化 NADPH 還原 GSSG 再生 GSH，同時 NADPH 脫氫生成 NADP+；NADPH 在 340 nm 有特 征吸收峰，相反 NADP+在該波長無吸收峰；通過測定 340 nm 吸光度下降速率來測定 NADPH 脫氫 速率，從而計算 GR 活性。

自備實驗用品及儀器：

紫外分光光度計、低溫離心機、水浴鍋、移液器、1mL 石英比色皿和蒸餾水

試劑組成和配置：

試劑一：液體×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加入 5.0 mL 蒸餾水，混勻。

試劑三：液體×1 支，4℃保存。

粗酶液提取：

1. 組織：按照組織質量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加 入 1mL 試劑一）進行冰浴勻漿。8000g，4℃離心 15min，取上清，置冰上待測。

2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL 試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時 間 3min）；然后 8000g，4℃，離心 15min，取上清置于冰上待測。

3. 血清等液體：直接測定。

操作步驟：

1. 分光光度計預熱 30 min，調節(jié)波長到 340 nm，蒸餾水調零。

2. 試劑一置于 25℃（普通物質）或者 37℃（哺乳動物）中預熱 30min。

3. 空白管：取 1mL 石英比色皿，加入 850μ L 試劑一，100μ L 試劑二，50μ L 試劑三，充分混 勻，于 340nm 處測定 10 s 和 190 s 吸光度，記為 A 空 1 和 A 空 2，△A 空白管= A 空 1﹣A 空 2。

4. 測定管：取 1mL 石英比色皿，加入 750μ L 試劑一，100μ L 試劑二，100μ L 上清液，50μ L 試劑三，充分混勻，于 340nm 測定 10 s 和 190 s 吸光度，記為 A 測 1 和 A 測 2，△A 測定管= A 測 1﹣A 測 2。

注意：空白管只需要測定一次。

計算公式： 

(1). 按蛋白濃度計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mg prot)= [ (△A 測定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反總×10⁹ ]÷[Cpr×V 樣]÷T = 536×(△A 測定管-△A 空白管)÷Cpr

(2). 按樣本質量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每克樣本每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個 酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/g)= [ (△A 測定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反總×10⁹ ] ÷(W×V 樣÷V 樣 總)÷T = 536×(△A 測定管-△A 空白管)÷W

(3) 按細胞數(shù)量計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每 10⁴個細胞每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/10⁴ cell)= [ (△A 測定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反總×10⁹ ] ÷(細胞數(shù) 量×V 樣÷V 樣總)÷T = 536×(△A 測定管-△A 空白管)÷細胞數(shù)量

（4）按液體體積計算

活性單位定義：在一定溫度中，pH8.0 條件下，每毫升液體每分鐘催化 1nmol NADPH 氧化為 1 個酶活單位。

GR 酶活(nmol/min/mL)= [ (△A 測定管-△A 空白管)÷ε ÷d×V 反總×10⁹ ]÷×V 樣÷T = 536×(△A 測定管-△A 空白管)

ε ：NADPH 摩爾消光系數(shù) 6.22×10₃ L/mol/cm；V 反總：反應體系總體積，1000μ L=0.001 L； 10⁶：1 mol=1×10⁶ μ mol； Cpr：上清液蛋白濃度（mg/mL）；V 樣：加入反應體系中上清液體 積，100μ L =0.1 mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；W，樣本質量，g；T：反應時間，3 min。

注意事項：

（1）樣品處理等過程均需要在冰上進行，且須在當日測定酶活力，勻漿液避免反復凍融；

（2）試劑二須現(xiàn)配現(xiàn)用，配制完后，置于冰上，未使用完的 4℃保存，三天內使用完。

（3）測定前須先用 1～2 個樣做預實驗，確保 180s 內吸光值變化呈線性，哺乳動物組織一般 須用試劑一稀釋 2～5 倍；

（4）細胞中 GR 活性測定時，細胞數(shù)目須在 300 萬-500 萬之間，細胞中 GR 的提取時可加試劑 一后研磨或超聲波處理，不能用細胞裂解液處理細胞。

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