檸檬酸合酶（Citrate Synthase，CS）試劑盒

商品貨號：QS1005
英文名稱：Citrate Synthase(CS)Assay Kit
別名：檸檬酸合酶試劑盒 CS Kit 檸檬酸合酶(CS）試劑盒 檸檬酸合酶(CS）測試盒,生化法試劑盒
檢測方法：常量法

測定意義：                           

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸循環個限速酶，是三羧酸循環主要調控位點之一。

測定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產生檸檬酰輔酶A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

貨號: QS1005-50                                          規格：50管/48樣

檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說明書

分光光度法

正式測定前務必取2-3 個預期差異較大的樣本做預測定。

測定意義：                          

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養細胞的線粒體基質中，是三羧酸循環個限速酶，是三羧酸循環主要調控位點之一。

測定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產生檸檬酰輔酶A，進一步水解產生檸檬酸；該反應促使無色的DTNB轉變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計、臺式離心機、水浴鍋、可調式移液器、1mL 玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體50mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑二：液體10mL×1 瓶，-20℃保存；

試劑三：液體1mL×1 支，-20℃保存；

試劑四：液體50mL×1 瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×2 支，4℃保存，臨用前加入800μL 無水乙醇，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑六：粉劑×4 支，-20℃保存，臨用前加入400μL 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑七：粉劑×2 支，-20℃保存，臨用前加入800μL 蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1. 稱取約0.1g 組織或收集500萬細胞，加入1mL 試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
2. 將勻漿600g，4℃離心5min。
3. 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
4. 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。
5. 在步驟（4）中的沉淀中加入200uL 試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3 秒，間隔10 秒，重復30 次），用于線粒體CS 測定。
6.  

1. 分光光度計預熱30min 以上，調節波長至412nm，蒸餾水調零。
2. 將試劑四、五、六和七在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。
3. 樣本測定

將上述試劑按順序加入1 mL 玻璃比色皿中，加試劑七的同時開始計時，在412nm 波長下記錄20 秒時的初始吸光度A1 和反應2min 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

CS 活性計算：

1. 按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘催化產生1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr此法需要自行測定樣本蛋白質濃度。

1. 按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g 組織每分鐘催化產生1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V 樣÷V 樣總）÷T=222.2×ΔA÷W

1. 按細菌或細胞密度計算：

單位的定義：每1 萬個細菌或細胞每分鐘催化產生1 nmol TNB 定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /104 cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V 樣÷V 樣總）÷T=0.4444×ΔA

V 反總：反應體系總體積，9×10-4 L；ε：TNB 摩爾消光系數，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.03 mL；V 樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/mL；W：樣本質量，g；500：細胞或細菌總數，500 萬。